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Jan 01, 2024

Lo studio decifra la via biosintetica dell'antidepressivo orcinolo glucoside

Scientists also engineered the production of orcinol glucoside in the

Gli scienziati hanno inoltre progettato la produzione dell'orcinolo glucoside nel lievito compatibile con le biotecnologie.

Le proprietà antidepressive dell’orcinolo glucoside (OG) sono ben consolidate. È presente soprattutto nel rizoma della Curculigo orchioides Gaertn, conosciuta anche come Xianmao in cinese. Secondo le testimonianze, l'OG ha una varietà di effetti farmacologici. Secondo alcune ricerche, l'ingrediente principale della C. orchidoids con attività antidepressiva potrebbe essere l'OG.

Tuttavia, a causa dell’estrazione inefficace delle piante e della sintesi chimica difficile e costosa, l’applicabilità commerciale dell’OG è rimasta limitata.

L'orcinolo sintasi (ORS) e la glicosiltransferasi UDP-dipendente (UGT) altamente attive coinvolte nella produzione di OG sono state scoperte in questo studio utilizzando un'efficace pipeline di screening. Utilizzando il sequenziamento del trascrittoma di C. orchidoides, l'analisi computazionale e la convalida funzionale in vitro, i ricercatori hanno potuto individuare il percorso.

La biosintesi dell'OG è inizialmente catalizzata dall'ORS, che è una polichetide sintasi di tipo III (PKS), tramite condensazione di 1 molecola di acetil-CoA e 3 molecole di malonil-CoA per generare orcinolo, che viene successivamente modificato con UGT al carbonio Gruppo idrossilico -3 o carbonio-5 per generare OG.

Gli scienziati hanno utilizzato analisi metaboliche e comparative del trascrittoma per esplorare i geni funzionali che codificano per ORS e UGT nel C. orchidoides. Hanno valutato la distribuzione dell'OG e del suo precursore orcinolo nelle radici e nelle foglie di C. orchidoides. I risultati hanno mostrato che l’OG era arricchito principalmente nelle radici, con un’abbondanza quasi 3 volte maggiore rispetto alle foglie. Allo stesso tempo, anche il contenuto totale di OG e orcinolo nelle radici era maggiore che nelle foglie.

Gli scienziati potrebbero anche identificare 5 candidati ORS da altre specie in base alla somiglianza delle sequenze. Tutti i geni candidati ORS sono stati caratterizzati utilizzando test di attività enzimatica in vitro con acetil-CoA e malonil-CoA come substrati.

L'UGT responsabile della formazione di OG in C. orchidoides rimane sconosciuto. Integrando il sequenziamento del trascrittoma, l'aggancio molecolare vincolato e la caratterizzazione funzionale, abbiamo costruito una pipeline per restringere il campo dei geni candidati che codificano per gli UGT. Le restrizioni dell'espressione genica e del legame con il substrato hanno rapidamente eliminato oltre il 90% dei potenziali candidati.

La convalida funzionale ad alta intensità di lavoro degli UGT candidati è stata quindi condotta solo su 6 geni, evitando noiosi test sperimentali. Questo processo offre un modo per scoprire nuove glicosiltransferasi e altri geni funzionali nei percorsi biosintetici dei prodotti vegetali naturali, che è stato applicato anche per costruire il database completo UGT delle piante pUGTdb.

Per migliorare la produzione microbica di OG, gli scienziati hanno considerato principalmente le cellule ospiti, l'ingegneria metabolica, il mezzo e le condizioni di fermentazione. Il microrganismo industriale emergente Y. lipolytica è naturalmente dotato di elevati flussi di carbonio verso acetil-CoA e malonil-CoA. Ad esempio, la sovraespressione dei geni endogeni YlPEX10 e YlACC1, che erano stati utilizzati per migliorare l’apporto di acetil-CoA e malonil-CoA, non ha migliorato la produzione di OG, indicando che l’apporto di precursori non era il fattore limitante.

Infatti, la sovraespressione dei geni a valle (CorcORS1 e CorcUGT31) nella via biosintetica dell’OG ha migliorato significativamente la produzione di OG. Allo stesso tempo, abbiamo scoperto che la scelta di un mezzo di fermentazione adatto determinava in gran parte la produttività ed era fondamentale per ridurre la sintesi dei sottoprodotti.

Dopo un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni di fermentazione fed-batch, la produttività dell'OG nel ceppo ingegnerizzato YL-G12 è stata migliorata di circa 100 volte rispetto al ceppo iniziale YL-G1.

Migliorando il percorso a valle, l'ingegneria metabolica e l'ottimizzazione della fermentazione, la produzione di OG nella Yarrowia lipolytica è stata migliorata di 100 volte, ottenendo una resa finale di 43,46 g/L (0,84 g/g DCW), che è quasi 6.400 volte superiore rispetto alla resa di estrazione dalle radici di C. orchidoides.